Q1：Как проверить 24-луночный планшет, 12-луночный планшет в дополнение к 96-луночному планшету, пример работы? A1: Добавьте культуральную среду в соотношении 1:10.
Q2: Как определить пустую лунку? A2: Существует два источника холостых показаний: восстанавливающие вещества и активность самих клеток. Пожалуйста, подтвердите следующие данные. -Восстанавливающие вещества: CCK-8 и тестируемый препарат могут быть добавлены в культуральную среду до начала формального эксперимента. Если произойдет изменение цвета, это подтвердит, что препарат обладает восстановительными свойствами. Для проведения официальных экспериментов, пожалуйста, смените культуральную среду перед добавлением CCK-8. -Изменение активности клеток: CCK-8 определяет активность клеток, поэтому изменение активности клеток приведет к изменению бланка, даже если количество клеток останется прежним. Поэтому необходимо убедиться в изменении активности клеток.
Q3: Как завершить реакцию? A3: Существует несколько методов (96-луночный планшет): 1. После завершения реакции развития цвета поместите планшет с культурой в холодильник при температуре 4℃. 2. 2. Добавьте 10 мкл 0,1 М раствора HCl в каждую лунку. 3. Добавьте 10 мкл 1% (w/v) раствора SDS (додецилсульфат натрия) в каждую лунку. Примечание: Измерения следует проводить в течение 24 часов после остановки реакции. 4. Используйте наш стоп-раствор для CCK-8 (артикул CK13).
Q4: Могу ли я использовать фильтры, отличные от 450 нм? A4：Можно использовать фильтры 430-490 нм, фильтр 450 нм является лучшим, WST-8 грязный спектр поглощения красителя:
Q5: Каковы условия транспортировки и хранения CCK-8? A5: Реагент можно стабильно хранить при температуре 4℃ в течение 24 месяцев. При необходимости длительного хранения его можно хранить при температуре -20℃, но не замораживать и не оттаивать многократно. При замене на другие контейнеры, пожалуйста, сначала проведите тест на стабильность, чтобы подтвердить стабильность реагента.
Q6: Сколько клеток должно быть инокулировано в одну лунку? О6: При использовании стандартного 96-луночного планшета минимальный объем инокуляции адгезивных клеток составляет не менее 1 000 клеток/лунку (100 мкл среды). Чувствительность при обнаружении лейкоцитов относительно низкая, поэтому рекомендуется инокулят не менее 2500 клеток/лунку (100 мкл среды). Для экспериментов с использованием 24- или 6-луночных планшетов рассчитайте соответствующий объем инокулята на лунку и добавьте раствор CCK-8 в количестве 10 % от общего объема среды на лунку.
В7: Могу ли я использовать для эксперимента 384-луночный планшет? A7: Да, можете. Добавьте 10% от объема среды раствора CCK-8 в каждую лунку. Если объем добавленного CCK-8 слишком мал, вы можете сначала разбавить раствор CCK-8 в 1 раз, а затем добавить 20% от объема среды.
Q8: Можем ли мы использовать 24-луночные планшеты для теста? A8: Да, можно. Добавьте 10% от объема среды раствора CCK-8 в каждую лунку.
Q9: Повлияет ли феноловый красный на тест? О9: Нет. Абсорбция фенолового красного в среде может быть устранена вычитанием абсорбции фона в пустых лунках при расчете, поэтому он не влияет на анализ.
В10: Существует ли корреляция между CCK-8 и анализом связывания тимидина? A10: Да. Однако, пожалуйста, обратите внимание, что поскольку CCK-8 использует другой принцип обнаружения, чем тимидиновый анализ, результаты могут отличаться.
В11: Может ли CCK-8 обнаружить бактериальные клетки? О11: Он может обнаружить E.coli, но не дрожжевые клетки. Добавьте 10 мкл раствора CCK-8 в 100 мкл среды для культивирования E.coli и инкубируйте в течение 1-4 часов или в течение ночи. Но более рекомендуется использовать наш артикул M439: Bacterial Activity Assay Kit.
Q12: Как уменьшить ошибку из-за остатков реагента CCK-8 на наконечнике или стенках лунки? A12: Вы можете разбавить реактив CCK-8 культуральной средой и перемешать его перед добавлением образцов.
Q13: Какого цвета CCK-8? A13: Он должен быть розовым. Если цвет отличается, это может повлиять на измерение.
В14: Может ли CCK-8 окрашивать живые клетки? О14: Не может. Это связано с тем, что основной компонент CCK-8 представляет собой водорастворимую соль тетразолия (WST®-8) и обменивается электронами с живыми клетками на WST®-8 в культуральной среде через переносчик электронов 1-Метокси-ПМС. Поскольку образующийся метокси PMS также хорошо растворим в воде, CCK-8 не может окрасить клетки.
В15: Является ли раствор CCK-8 токсичным для клеток? О15: Раствор CCK-8 сам по себе немного токсичен из-за присутствия высоких концентраций 1-метокси PMS. Однако CCK-8, добавленный в культуральную среду, не токсичен, поскольку разбавлен в 10 раз. Поэтому возможна длительная инкубация, например, на ночь или в течение нескольких дней. После анализа CCK-8 эту же культуру клеток можно использовать для других анализов пролиферации клеток, таких как анализ с кристаллическим фиолетовым, нейтральным красным или флуоресцентным анализом ДНК. Поскольку каждая клетка по-разному переносит CCK-8, при необходимости длительного культивирования сначала проверьте жизнеспособность клеток после добавления CCK-8 в культуру.
Вопрос 16: Влияет ли препарат на анализ при проведении эксперимента с добавлением? Как решить эту проблему? A16：В некоторых случаях эффект будет. Если препарат является восстановителем, он будет вступать в реакцию развития цвета с CCK-8 и увеличивать абсорбцию. Решение: Прежде всего, проверьте, поглощается ли препарат или нет, добавьте CCK-8 в среду, содержащую препарат, и измерьте поглощение при 450 нм, если поглощение выше, чем в среде без препарата (с CCK-8), то это доказывает, что препарат оказывает эффект, и вы можете изменить среду, чтобы устранить эффект препарата перед добавлением CCK-8.
Q17：Какова причина разных значений в каждом измерении? Как решить эту проблему? A17: Причин может быть несколько: 1. При инкубации в инкубаторе лунки в крайнем круге культурального планшета, скорее всего, высохнут и улетучатся, что увеличит ошибку из-за неточного объема. Обычно в крайний круг лунок добавляют только культуральную среду и не используют в качестве измерительной лунки. 2. существует вероятность ошибки из-за окрашивания стенок CCK8. рекомендуется слегка постучать по культуральному планшету после добавления CCK-8, чтобы облегчить перемешивание. 3. Слишком много или слишком мало клеток в лунке. Пожалуйста, заранее определите условия в диапазоне 1,000-100,000 клеток/лунку.
Q18: Как создать пустой контроль? A18: Добавьте CCK-8 в бесклеточную среду, инкубируйте в течение определенного периода времени и измерьте поглощение при 450 нм в качестве холостого контроля. При проведении эксперимента с добавлением лекарств (эксперимент на цитотоксичность) необходимо также учитывать поглощение лекарства, поэтому CCK-8 можно добавить в среду без клеток и с добавлением лекарства, инкубировать в течение определенного периода времени и измерить поглощение при 450 нм в качестве холостого контроля.
Q19：Какие вещества влияют на определение CCK-8? A19：На определение CCK-8 влияет присутствие восстанавливающих веществ, таких как глюкоза, содержащая витамин C. (Количество в среде обычно небольшое, и феноловый красный или сыворотка не влияют на определение). В присутствии фенолового красного увеличивается поглощение в холостом состоянии, но это не влияет на измерение, и поглощение в холостом состоянии может быть вычтено.
Q20：Как решить проблему, если значение абсорбции слишком высокое в эксперименте, и если количество клеток не может быть уменьшено? A20：Вы можете сократить время инкубации после добавления CCK-8. Например, время инкубации после добавления реагента CCK-8 можно сократить с 2 часов до 1 часа.
Q21: Какова цель установки опорной длины волны? Обязательно ли ее устанавливать? A21: Нет необходимости устанавливать опорную длину волны; реагент CCK-8 не поглощает при опорной длине волны. Целью установки опорной длины волны является устранение поглощения из-за мутности образца.
Q22: В инструкции указан метод измерения только для 96-луночных планшетов, если я использую 24-луночный планшет с 12 лунками, сколько реагента CCK-8 я должен добавить? О22: Как правило, рекомендуется добавлять 1/10 объема культуральной среды для реагента CCK-8.
В23: Нужно ли предварительно культивировать клетки? О23: Не обязательно. Рекомендуется предварительно культивировать клетки, если это необходимо для поддержания клеток в наилучшем состоянии. Если не проводить предварительное культивирование клеток, дегидрогеназа в них может быть нестабильной. Некоторые люди также не проводят предварительное культивирование клеток, но им необходимо унифицировать условия анализа при построении стандартных кривых и анализов.
В24: Если добавляемый препарат содержит металл, будет ли он оказывать какое-либо влияние? О24: Металлы влияют на развитие цвета CCK-8. При конечной концентрации 1 Мм хлорид свинца, хлорид железа и сульфат меди подавляют реакцию окрашивания на 5%, 15% и 90% и снижают чувствительность. Если конечная концентрация составляет 10 Мм, они подавляют реакцию на 100%.
Q25: Нужно ли менять среду для подсчета клеток после предварительного культивирования? A25: Как правило, достаточно обработать клетки в логарифмической фазе роста трипсином, подсчитать их с помощью гематокритных дисков и приготовить определенную концентрацию клеточной суспензии. Если вы хотите точно подсчитать клетки, можно взять культуральную среду после предварительной культуры и подсчитать их с помощью гематокритных дисков.
В26: Обладает ли CCK-8 одинаковой чувствительностью для разных клеток? О26: Нет. Суспензионные клетки труднее окрашивать по сравнению с адгезивными. Для адгезивных клеток абсорбция обычно уже высока при добавлении CCK-8 в течение 1-4 часов инкубации, но для суспензионных клеток она может быть ниже, что можно решить, продлив время добавления CCK-8 или увеличив количество клеток.
Q27: В чем разница в количестве между суспензионными и адгезивными клетками? A27: Суспензионные клетки труднее окрашиваются, поэтому обычно необходимо увеличить количество клеток и продлить время инкубации. Прилипшие клетки легче окрашиваются, если количество клеток слишком велико, иногда поглощение будет превышать показания ферментного маркера.
В28: Нужно ли каждый раз строить стандартную кривую? О28: Рекомендуется делать это каждый раз. Хотя клетки одинаковые, состояние клеток не обязательно одинаковое, для клеток с разным состоянием рекомендуется проводить стандартную кривую каждый раз. Если номера партий реагентов разные, может быть небольшая разница в чувствительности, поэтому рекомендуется проводить стандартную кривую отдельно для разных партий. Q29：Иногда клетки погибают под действием лекарств, но активность дегидрогеназы сохраняется, можно ли подсчитать количество клеток? A29: Нет. Поскольку CCK-8 косвенно отражает количество живых клеток, реагируя с внутриклеточной дегидрогеназой, подсчитать количество живых клеток не представляется возможным.