1. низкая скорость выделения РНК.
(1) Неправильно сохраненные образцы или образцы, хранившиеся слишком долго. Неправильно сохраненные образцы или образцы, хранившиеся слишком долго, могут привести к деградации РНК. Соберите свежие образцы или образцы, хранившиеся при температуре -70℃ или в жидком азоте после флэш-замораживания в жидком азоте.
(2) Недостаточная гомогенизация или измельчение жидким азотом. Недостаточная гомогенизация или измельчение жидким азотом приводит к недостаточному лизису, что приводит к недостаточному выделению РНК.
(3) Низкое содержание РНК в тканях или клетках: количество РНК варьируется в различных клетках и тканях, поэтому для определения подходящего начального объема образца необходимо провести предварительное тестирование.
(4) Слишком маленький или слишком большой начальный объем ткани: если объем образца слишком мал, содержание РНК в клетках и тканях будет низким; если объем образца слишком велик, он может превысить расщепляющую способность лизата, и расщепление будет неполным, что приведет к низкому выходу РНК или снижению качества.
(5) Неадекватная элюция.В центр мембраны очистительной колонки по каплям добавляли ddH2O, не содержащий РНК. Объем элюирования очистительной колонки составляет 50-200 мкл. Если эффект элюирования неудовлетворительный, можно добавить безреагентную ddH2O, предварительно нагретую при 65 ℃, затем продлить время при комнатной температуре и центрифугировать для повторного элюирования.
2. Проблема засорения колонок гДНК-фильтра.
(1) Слишком большой объем образца. Данный набор подходит для выделения 10-20 мг тканей животных или 2-5×106 клеток, чрезмерное количество тканей снизит выход, а также чистоту, поэтому количество используемых образцов следует уменьшить во время работы.
(2) Образец богат мышечными волокнами. Мышцы, сердце и кожа богаты мышечными волокнами, молекулярный вес мышечных волокон высок, что приведет к засорению колонки, а использование измельчения жидким азотом уменьшит явление засорения при обработке образцов.
(3) Недостаточное измельчение или гомогенизация тканей. Недостаточное измельчение или гомогенизация обломков может привести к засорению колонки. Лизированную жидкость следует сначала центрифугировать при 13 000×g в течение 5 минут, а супернатант затем добавить в колонки с гДНК-фильтром.
3, Деградация РНК.
Деградация РНК после очистки связана с качеством образца, наличием в нем РНКазы, способом работы и другими факторами:
(1) Образцы вызывают деградацию РНК из-за того, что они не хранятся своевременно. Образцы тканей или клеток хранятся при температуре -80℃ после флэш-замораживания жидким азотом, если они не были собраны вовремя для последующих экспериментов.
(2) Образцы неоднократно замораживались и размораживались. При хранении образцов тканей храните их небольшими кусочками, чтобы избежать деградации образцов из-за многократного замораживания и оттаивания.
(3) Электрофорез. Обычная деградация РНК частично вызвана процессом электрофореза. Перед электрофорезом замочите емкость для электрофореза в 3% перекиси водорода на 20 мин, затем промойте ее без РНКазы в ddH2O и сконфигурируйте буфер для электрофореза с без РНКазы в ddH2O.
(4) Убедитесь, что пробирки и центрифужные пробирки, используемые в процессе экстракции, не содержат РНК.
(4) Выделенная РНК была загрязнена геномной ДНК.
Содержание ДНК и РНК в клетках различных видов тканей сильно варьирует, поэтому не превышайте 20 мг ткани и 5×106 клеток. Если печень, селезенка и почки богаты ДНК, пожалуйста, не превышайте 10 мг, иначе это приведет к избытку геномных остатков. Колонки gDNA-Filter могут эффективно удалить большую часть ДНК в системе, если последующие эксперименты очень чувствительны к следовым количествам ДНК, вы можете выбрать использование следующих вариантов в зависимости от конкретных обстоятельств:
(1) Используйте DNase I, входящую в комплект, для переваривания на мембране, чтобы удалить загрязнение ДНК.
(2) При разработке праймеров используйте транс-интронные праймеры, что позволяет избежать участия шаблонов геномной ДНК в реакции амплификации.
(3) Выбирайте для обратной транскрипции реагенты, содержащие модули удаления генома.