Меры предосторожности при проведении вестерн-блота и часто задаваемые вопросы:
1 Некоторые из моих клеточных экстрактов выпадают в осадок, некоторые прозрачны, почему? О: Осадки могут выпадать из-за того, что ваш белок не был полностью денатурирован, вы можете увеличить концентрацию SDS, и в то же время продлить время кипячения образца; или не исключайте, что концентрация вашего антигена слишком высока, и тогда добавьте соответствующее количество буфера к образцу.
2 Молекулярная масса моего белка очень мала (10 KD), как проводить ВБ? О: Вы можете выбрать мембрану 0,2 мкм и сократить время переноса. Вы также можете сложить две мембраны вместе и перенести их.
3 Что лучше использовать - DAB или ECL для окончательного развития цвета? О: DAB токсичен, но более чувствителен, это самый чувствительный субстрат для HRP; ECL легко контролировать результат, но чувствительность немного хуже, когда он катализируется, но если он достигает порога, он будет особенно чувствительным, и он может обнаружить pg белка, в зависимости от ситуации вашего эксперимента.
4 Нужно ли проводить иммуногистохимию и вестерн-блот, чтобы проверить наличие или отсутствие белка на определенной клетке? Можно ли использовать первичное антитело и вторичное антитело вместе в этих двух тестах? A: ① Иммуногистохимия может быть использована для локализации, но не точного количественного определения, и иногда будут ложноположительные результаты, нелегко отличить от фона; Вестерн-блот может специфически обнаружить молекулу белка, количественное определение, но не локализацию. Первичное антитело для двух видов экспериментов иногда не может быть использовано универсально, в описании продукта компании обычно объясняется, какие эксперименты можно проводить, и подходит ли оно для парафинового или замороженного среза в иммуногистохимии.
5 Уровень клеток для вестерн-блота, сколько клеток нужно для извлечения достаточного количества белка для вестерн-блота? A: Как правило, достаточно 5×106.
6 Можно ли одновременно выделять РНК и белок из одного и того же образца? Повлияет ли это на вестерн-блот? О: Да, никаких проблем нет.
7 Можно ли подвергнуть один и тот же образец белка вестерн-блоту на два фактора одновременно? О: Конечно, можно, некоторые даже могут измерять десятки образцов одновременно.
8 Как долго можно хранить белок после денатурации? О: -80℃, без проблем в течение одного-двух лет. Наиболее важные два условия: не подвергаться гидролизу протеазой; не подвергаться перевариванию бактериями (также гидролизуется ферментом). 9 Вторичное антитело - это биотинилированное антитело, а третичное антитело - аффинная биотиновая система. Интересно, нужно ли корректировать раствор, используемый для защиты, после применения такой схемы, и можно ли снова использовать 5% обезжиренное сухое молоко? О: Мы не можем использовать обезжиренное сухое молоко, потому что оно содержит биотин, лучше использовать BSA.
10 Как обращаться с образцами при проведении вестернизации образцов тканей? О: Необходимо измельчать, гомогенизировать, сонировать, растворимость белков будет лучше, центрифугирование должно быть достаточным, мембранные белки должны быть извлечены более энергичным способом, а белки мембран с низким содержанием могут быть извлечены поэтапно (ультрацентрифугирование). Еще один момент - протеазы более активны в тканях, поэтому необходимо следить за тем, чтобы не подавлять активность протеаз.
11 Можно ли использовать одно и то же антитело для иммуногистохимии и вестерн-блота? О: Антитела для иммуногистохимии распознают неденатурированные антигенные детерминанты (также известные как эпитопы), некоторые эпитопы являются линейными, а другие - конформационными; линейные эпитопы не подвержены денатурации белка и содержатся как в натуральных, так и в кипяченых белках; конформационные эпитопы, из-за ограничений в пространственной структуре белков, исчезают после денатурации кипяченой воды. Если используемое вами антитело распознает несколько последовательных аминокислот в белке, то есть линейный эпитоп, то это антитело можно использовать как для иммуногистохимии, так и для вестерна, тогда как если антитело распознает конформационный эпитоп, то его можно использовать только для иммуногистохимии.
12 Какова цель замачивания PVDF-мембраны в метаноле при проведении Вестерн-блота? О: Цель замачивания ПВДФ-мембраны в метаноле - активировать положительно заряженные группы на верхней части ПВДФ-мембраны, чтобы она легче связывалась с отрицательно заряженными белками, и это также является целью добавления большего количества метанола при переносе белков малых молекул.
13 Могут ли фосфорилированные и нефосфорилированные антигены одного и того же антитела быть обнаружены на одной и той же мембране? Ответ: Да.
14 Молекулярная масса белка охватывает большой диапазон, например, для разделения малых 21KD, средних до 66KD, больших до 170KD, можно ли это сделать за один раз? О: Не очень хорошо передавать такое широкое распределение, общее предложение: 21KD и 66KD могут быть переданы вместе, 12% SDS-PAGE, мокрый перенос 120mA, 45-60мин может быть достаточно, может быть скорректировано в соответствии с опытом вашей лаборатории; 170KD с 7% SDS-PAGE, 200mA 90-120мин.
15 Существуют ли какие-либо принципы выбора ингибиторов протеаз для клеточных лизатов? Зависит ли это от происхождения ткани? Есть ли разница между цитозолем и цитозолем? О: В целом, достаточно добавить ингибиторы протеаз широкого спектра действия во время экстракции и поддерживать низкую температуру во время работы. Если есть особые требования, вы можете выбрать подходящий ингибитор протеазы.
16 Каков принцип связывания белка мембраной PVDF и нитратной мембраной? A: Вообще говоря, нитроцеллюлозная мембрана связана с белком через гидрофобный эффект, в этом случае после многократной промывки несколько раз, белок легко отпадает, и результат плохой, PVDF мембрана в основном через положительный заряд на своей мембране и связь белка, а также имеет гидрофобный эффект, но он относительно слабый. В этом случае мембрана ПВДФ и белок более прочно связаны, не так легко отпадают, и результат получается лучше.
17 Как правильно выбрать внутренний эталон для вестерн-блота? Для цитоплазматических и цельноклеточных белков мы можем выбрать β-актин, GAPDH и тубулин; для митохондриальных белков мы можем выбрать VCDA1/Porin и COXIV; а для внутриядерных антигенов мы можем выбрать Lamin B1, TBP и гистоны.
18 Не удается перенести белки с большой молекулярной массой в лунку мембраны, и эффективность переноса низкая? A: Добавьте 20% метанола (конечная концентрация) в буфер переноса, потому что метанол может снизить эффективность элюции белка, но может увеличить связывающую способность белка и NC мембраны, метанол может предотвратить деформацию геля, метанол может продлить время переноса для высокомолекулярных белков; добавьте 0,1% SDS к конечной концентрации буфера переноса, который также может увеличить эффективность переноса; используйте глутаральдегид для сшивания; уменьшите концентрацию геля, например, до 6-7% или увеличьте напряжение переноса/напряжение трансфекции/время трансфекции. 7% или увеличьте напряжение/ток переноса, чтобы увеличить время переноса.
19 Набухание или скручивание геля во время переноса мембраны? О: Перед переносом гель можно замочить в буфере для переноса на 5-10 минут.
20 Полоска геля перекошена или смещена? О: При длительном использовании электротрансферометра губка истончается, структура "сэндвича" не компактна, ее можно заменить или между двумя губками положить понемногу обычной соломенной бумажной прокладки.
21 После переноса на пленке остаются одиночные или множественные белые пятна? О: Убедитесь, что между пленкой и клеевым блоком нет воздушных пузырьков при переносе пленки.
22 Буфер слишком горячий? О: Концентрация ионов в буфере слишком низкая, ток или напряжение слишком высокие, обратите внимание на охлаждение в процессе переноса пленки.
23 После проявки фон пленки слишком высок? О: Пленка PVDF не полностью смочена 100% метанолом перед переносом; пленка недостаточно промыта, количество раз промывки пленки может быть увеличено; закрытие неполное, выберите подходящий раствор для закрытия и улучшите время закрытия; концентрация вторичного антитела слишком высокая, уменьшите концентрацию вторичного антитела; специфичность первичного антитела не сильная, замените его на моноклональное антитело с сильной специфичностью; время экспозиции слишком большое, уменьшите время экспозиции.
24 Нет полос или очень светлые полосы, слабые сигналы гибридизации? О: Образец не содержит целевого белка или его содержание слишком мало, можно увеличить количество белка в образце, установить известное стандартное количество белкового контроля; коэффициент разведения антител слишком мал, время инкубации недостаточно; мембрана для переноса некачественная, после переноса мембраны можно использовать для наблюдения за эффектом окрашивания лихунским красным; время экспозиции слишком мало, увеличьте время экспозиции; антитело не сохранилось должным образом, потенция антитела снижена.
Положение 25-целевой полосы низкое или высокое? О: Концентрация геля не подходит, высокомолекулярные белки должны использовать гель с низкой концентрацией, низкомолекулярные белки должны использовать гель с высокой концентрацией.
26 Что такое неспецифические полосы? О: Целевой белок имеет несколько сайтов модификации (сайты фосфорилирования, гликозилирования, ацетилирования и т.д.), которые могут представлять несколько полос; специфичность первичного антитела не очень хорошая, используйте моноклональное антитело с лучшей специфичностью; результаты вызваны неспецифичностью вторичного антитела, вы можете создать группу параллельного контроля без добавления первичного антитела и только добавить вторичное антитело, чтобы определить, имеет ли вторичное антитело неспецифическое связывание; белки образца могут быть деградированы, поэтому обратите внимание на работу на льду при извлечении белков, и добавить соответствующие ингибиторы протеаз. Белки образца могут разрушаться, поэтому при выделении белков обратите внимание на работу на льду, добавьте соответствующие ингибиторы протеазы и избегайте повторного замораживания и оттаивания образцов; концентрация антител слишком высока, уменьшите концентрацию первичного антитела и вторичного антитела.
27 Пленка пустая, в чем дело? О: Если следующие проблемы можно исключить, то проблема, скорее всего, кроется в первичном антителе и подготовке антигена. Активность HRP вторичного антитела слишком сильна и поглощает субстрат; H2O2 в субстрате ECM нестабилен и инактивирован; субстрат ECL не покрывает соответствующую позицию; вторичное антитело инактивировано.
28 Целевая полоса белая с фоном вокруг нее? О: Содержание целевого белка слишком велико; концентрация первичного антитела высока, а каталитическая активность HRP на вторичном антителе слишком сильна.