Часть 1 Ненормальные кривые амплификации Нормальные кривые амплификации обычно имеют S-образную форму, а значения Ct предпочтительно находятся в диапазоне от 20 до 30. Ненормальные кривые амплификации включают большие значения Ct, отсутствие периода плато и уменьшение периода плато. 1. большое значение Ct (например, значение Ct >30)
(1) Низкое количество шаблона или низкое обилие экспрессии гена, рекомендуется увеличить количество шаблона, чтобы увидеть, может ли значение Ct быть уменьшено на соответствующий фактор.
(2) Неподходящие условия реакции qPCR или неправильно подобранные праймеры, что приводит к низкой эффективности амплификации, рекомендуется подтвердить эффективность амплификации с помощью стандартной кривой.
(3) Слишком длинный продукт амплификации, рекомендуется использовать трехступенчатую процедуру амплификации или оптимизировать праймеры, длина продукта амплификации не должна превышать 300 п.н.
(4) В системе могут присутствовать ингибиторы, влияющие на активность фермента, рекомендуется разбавить шаблон в градиенте или повторно подготовить шаблон с более высокой степенью чистоты.
2. кривая амплификации не достигает периода плато Обилие генов низкое, а количество циклов небольшое, рекомендуется увеличить количество циклов или выбрать продукты, подходящие для количественного определения генов с низким содержанием.
3. уменьшение периода плато кривой амплификации Это может быть связано с неправильной установкой диапазона базовой линии, что обычно вызвано слишком большим количеством шаблона. Рекомендуется уменьшить значение конечной точки базовой линии (обычно рекомендуется установить значение Ct -4), после настройки см. следующий рисунок.
4. Зазубренный период плато кривой амплификации
(1) Чистота РНК низкая, рекомендуется увеличить разведение шаблона в градиенте, чтобы увидеть эффект оптимизации, или повторно подготовить РНК высокой чистоты для повторного эксперимента.
(2) Прибор не калибровался в течение длительного времени, рекомендуется регулярно калибровать и обслуживать прибор.
5. кривая амплификации нечеткая и неравномерная. возможно, концентрация ROX не соответствует модели, рекомендуется отрегулировать концентрацию ROX, после регулировки см. рисунок ниже. Примечание: Вы можете изменить настройку эталонного красителя с ROX на NONE на приборе, отменить функцию коррекции ROX и проверить, пришла ли кривая амплификации в норму, чтобы определить, вызвана ли она ROX.
6. кривая плавления есть, а кривой амплификации нет. возможно, программа амплификации установлена неправильно и сигнал флуоресценции не собирается, поэтому рекомендуется провести повторный эксперимент и увеличить сбор сигналов флуоресценции на этапе удлинения программы амплификации.
7. кривая амплификации имеет скачки вверх или вниз Это может быть неисправность прибора, рекомендуется отремонтировать прибор.
8. отрицательный контроль имеет усиление
(1) NTC имеет амплификации, могут быть следующие два случая: ① Ct>35, кривая плавления Tm значение <80 ℃ (общие нормальные продукты qPCR, размер между 100-300bp, кривая плавления Tm в основном выше 80 ℃), может быть результатом праймера димер, может быть дальнейшая оптимизация праймеров. ② Существует значение Ct и <35, что указывает на загрязнение реакционной системы, и источник загрязнения может быть устранен шаг за шагом.
(2) NRC имеет амплификацию NTC в норме, NRC имеет значение Ct, возможно, РНК содержит загрязнение гДНК. Рекомендуется переварить РНК с помощью DNase I или использовать набор для обратной транскрипции, содержащий средства для удаления гДНК (например, Cat NO.11141ES). [Примечание] NTC - реакция отрицательного контроля, в которой вместо шаблона используется H2O; NRC - реакция отрицательного контроля, в которой в качестве шаблона используется необратно транскрибированная РНК.
9. Плохая воспроизводимость дубликатов лунок
1) Причины ошибки добавления, рекомендуется регулярно калибровать пипетку, кроме того, ее можно оптимизировать, расширив реакционную систему или заранее приготовив хороший премикс.
2) Низкий объем шаблона, рекомендуется увеличить объем шаблона, чтобы значение Ct находилось в диапазоне 15-30.
(3) Прибор не калибровался в течение длительного времени, рекомендуется регулярно калибровать и обслуживать прибор.
Часть2 Аномалии кривой плавления Кривая плавления часто используется для определения специфичности результатов qPCR, идеальная кривая плавления представляет собой один пик, аномальная кривая плавления может иметь двойные пики, беспорядок и так далее, ниже мы приводим анализ по очереди.
1. Кривая плавления с двойными пиками
1）Двойные пики, ложные пики Tm до 80 ℃ ① Может быть димер праймера, рекомендуется уменьшить концентрацию праймера или перепроектировать праймер и другие способы оптимизации. ①Возможен димер праймера, рекомендуется уменьшить концентрацию праймера или изменить дизайн праймера для его оптимизации. ②Количество шаблона может быть слишком низким, что способствует образованию димера праймера.
(2) Двойные пики, разные пики Tm после 80 ℃ ① Специфичность праймера слишком низкая, что приводит к неспецифической амплификации продукта, рекомендуется проверить специфичность праймера или перепроектировать праймеры. ② загрязнение гДНК, может быть подтверждено NRC. Если NRC имеет значение Ct, шаблон может быть подготовлен повторно.
2. кривая плавления один пик, но не резкий Могут быть неспецифические продукты аналогичного размера, рекомендуется подтвердить с помощью электрофореза агарозы высокого разрешения.
3. Одиночный пик на кривой плавления, но значение Tm до 80 ℃ Предположительно нет шаблона, только димерная амплификация праймера. Подтвердите продукт с помощью электрофореза агарозы с высоким разрешением или повторите эксперимент.
4. пики кривой плавления хаотичны
1) Загрязнение реакционной системы, подтвердите загрязнение, объединив результаты NTC и NRC, и предложите устранить загрязнение поочередно из воды, праймера, фермента и окружающей среды.
(2) Отказ реагентов из-за воздействия сильного света или высокой температуры, предложите использовать новые реагенты для сравнения.
(3) Прибор не калибровался в течение длительного времени, рекомендуется регулярно калибровать и обслуживать прибор.
4) Расходные материалы не соответствуют прибору, подтвердите требования соответствующего прибора к расходным материалам.
5) Кривая амплификации, кривая плавления отсутствует Возможно, программа плавления установлена неверно, и сигнал флуоресценции не собирается, поэтому рекомендуется повторить эксперимент и увеличить сбор сигнала на этапе кривой плавления.
6. при параллельном сравнении двух реагентов значение Tm одного и того же продукта отличается. Возможно, разные реагенты имеют разный состав или содержание про-растворительной цепи, что приводит к разному значению Tm одного и того же продукта при температуре растворения.
7. передний конец кривой плавления может быть несоответствие между концентрацией ROX и моделью, рекомендуется отменить калибровку ROX, чтобы увидеть, если кривая плавления в норме, отрегулированы, как показано ниже. Примечание: Вы можете изменить настройку эталонного красителя с ROX на NONE на приборе, отменить функцию коррекции ROX и проверить, вернулась ли кривая плавления в норму или нет, после чего вы сможете решить, вызвано ли это ROX или нет.