1. Лучше ли светочувствительность ECL?
Нет. В большинстве экспериментов концентрация белка находится на уровне пг-нг, и можно выбрать подходящий люминесцентный раствор.
2. Почему нужно хранить ECL вдали от света?
Люминал и другие люминесцентные компоненты в ECL легко инактивируются светом, поэтому их нужно хранить вдали от света.
3. сигнал целевого белка слабый или отсутствует.
Одна из распространенных проблем при люминесцентном анализе Вестерн-блота - слабый или отсутствующий сигнал целевого белка. Во-первых, проверьте, не является ли перенос мембраны недостаточным/избыточным, если да, оптимизируйте условия переноса мембраны; во-вторых, при условии правильного переноса мембраны проверьте, не слишком ли низка чувствительность антитела-антигена, не снижена ли активность субстрата HRP или субстрата, что можно решить увеличением объема образцов/увеличением концентрации антитела/использованием чувствительного субстрата/удлинением времени прессования пленки. Короткое время экспозиции также может снизить сигнал белка, поэтому увеличьте время экспозиции пленки.
4. высокий фон.
Глубокий фон - это наиболее распространенная проблема при люминесцентной детекции вестерн-блотов, и существует множество причин глубокого фона. Во-первых, проблема закрытия, условием закрытия обычно является 5% молоко или БСА, закрытые при комнатной температуре в течение 2-4 часов, но лучше 4 ночи; на самом деле молоко хорошо работает для большинства антител, но вторичные антитела и молоко могут иметь перекрестную реакцию, поэтому промывка имеет важное значение. Кроме того, BSA содержит один белок, что снижает фон, вызванный другими компонентами молока. Во-вторых, неполное элюирование TBST также может привести к темному фону; увеличение времени элюирования, частоты и дозировки соответствующим образом может уменьшить цвет фона. В-третьих, глубокий фон полосы также связан со временем экспозиции, время экспозиции более получаса является очень нормальным, поэтому рекомендуется экспонировать в течение 1-10 минут, если это возможно. вестернблот люминесцентный реагент EnlightTM производства Ingunn содержит уникальный усилитель люминесценции и точный люминесцентный субстрат, который имеет более высокую чувствительность и стабильность, чем обычный люминесцентный реагент и время люминесценции долго и фон ниже. Фон ниже. В-четвертых, если концентрация антиген-антитело/HRP слишком высока, они будут прямо или косвенно связываться с мембраной и не смогут быть вымыты и т. д. Следует уменьшить концентрацию антитела или объем образца белка.
5. неспецифические полосы
Неспецифические полосы связаны с перекрестной реактивностью антител. Моноклональные антитела обладают лучшей специфичностью и более высокой чистотой, чем поликлональные. Кроме того, необходимо соответствующее разведение концентрации первичного/вторичного антитела. Если в процессе обработки происходит деградация образца, его обрабатывают ингибитором белка, работающим на льду.
6. после проявки полоса на мембране становится желтой или белой.
Чувствительность или фон могут быть слишком высокими из-за слишком высокого содержания HRP, поэтому концентрацию антител следует уменьшить.
7. внутри полос есть белые пятна, которые не развиваются.
Это связано с операцией переноса и развития мембраны. Постарайтесь уравновесить мембрану перед переносом и следите за тем, чтобы между гелем и мембраной не было пузырьков воздуха.
8. разбросанные маленькие круглые пятна
Это вызвано наличием частиц примесей в растворе для запечатывания молока. Чтобы решить эту проблему, вы можете заранее приготовить раствор для запечатывания и хранить его при температуре 4 градуса Цельсия, не смешивать его при использовании и использовать только верхний слой.